0
01:42:46 - 29.09.2021
Валюта: Р (RUB)
  • Р (RUB)
  • (THB)
  • $ (USD)
  • € (EUR)
  • ₴ (UAH)
17:45:36 - 28.07.2021

Доказано влияние экстракта растения clitoria ternatea на раковые клетки

Доказано влияние экстракта растения clitoria ternatea  на раковые клетки

Аннотация

Водные и метанольные экстракты цветов Клитория тройчатая (КТ), известные своим применением для окрашивания риса в синий цвет при приготовлении блюда НасиКерабу (NasiKerabu), были выбраны для исследования цитотоксического эффекта на шесть типов здоровых и раковых клеточных линий. Среди данных типов: гормонозависимая клеточная линия рака молочной железы (MCF-7), гормононезависимая клеточная линия рака молочной железы (MDA-MB-231), клеточная линия рака яичника человека (Caov-3), клеточная линия рака шейки матки человека (Hela), клеточная линия рака печени человека (HepG2) и клеточная линия фибробласта крайней плоти человека (Hs27).

Противополиферативное действие экстрактов было изучено путем применения колориметрического МТТ(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5 дифенил-тетразолиум бромид) теста во временных интервалах 24 часа, 48 часов и 72 часа. Предварительные результаты показали, что водный экстракт КТ оказал серьезное воздействие (p< 0,05) против MCF-7 при значении IC50 равном 175,35 мкг/мл. Более того, водные и метанольные экстракты исследовались при помощи Газовой хроматограммы-Масс-спектрометрии (ГХ-МС).

Анализ водного экстракта при помощи ГХ-МС показал пять пиков, которые проявили компоненты водного экстракта, а именно инозитол (38,7%) и пентаналь (14,3%). В метанольном экстракте были выявлены пятнадцать компонентов, основными среди которых были инозитол (33,6%), циклогексен, 1-метил-4-(1-метилэтилидем) - (7,1%), уксусная кислота, циано - (6,5%) и хирустен (5,7%). Тесты показали очень низкое содержание тяжелых металлов. Анализ, проведенный на цветах, представляет надежную основу для признания медицинской и пищевой ценности КТ.

Введение

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) заявила, что в 2030 году общая смертность по причине рака вырастет до 12 миллионов, тогда как в 2005 году эта цифра составила 7,6 миллионов  (Фаруки (Farooqui) и др., 2011). В 2006 году Национальный раковый реестр (NationalCancerRegistry) заявил о 21773 случаях диагностирования рака в Западной Малайзии (Зайнал (Zainal) и др., 2006). В последнее время химиопрофилактика рака стала основным предметом исследований среди ученых (Ким (Kim) и др., 2010).

Лечение, направленное против рака, например, химиотерапия, лучевая терапия, гормональная терапия и иммунотерапия, могут убить как раковые, так и здоровые клетки (Купер (Cooper), 1993). По этой причине потенциальное использование натуральных продуктов в качестве противоракового лечения интенсивно исследовалось учеными (Ван-Нор Изза (Wan-NorIzzah) и др., 2009).

КТ относится к семейству бобовых (стручковых) (Моррис (Morris), 2009). Стебельки данного растения вьющиеся, травянистые, высокие и тонкие с пятью листочками, цветовая же гамма цветка разниться от белого до синего с белой или желтой сердцевиной (Джейн (Jain) и др., 2003). Цветок также известен под названием "мотыльковый горошек", в Малайзии же более распространено название "Бунгателанг" (Bungatelang). 

Цветки КТ используются для окрашивания риса в синий цвет при приготовлении блюда НасиКерабу, которое очень популярно в Малайзии.   Все части КТ используются в качестве лекарства, применяются в народной медицине для лечения различных болезней (Мухерьйи(Mukherjee) и др., 2008). Основной целью данного исследования является определение химического состава цветков КТ и исследование влияния их водного и метанольного экстрактов на здоровые и раковые клеточные линии.

Материалы и метод

Цветки КТ были собраны в октябре 2010 года в деревне КампунгСеронок (KampungSeronok), в окрестностях города БайанЛепас (BayanLepas), штат Пинанг, Малайзия.

Hs27 (ATCC® CRL-1634™, клеточная линия фибробласта крайней плоти человека ), MCF-7 (ATCC® HTB-22™, гормонозависимая клеточная линия рака молочной железы ), MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26™, гормононезависимая клеточная линия рака молочной железы) Caov-3(ATCC® HTB-75™, клеточная линия рака яичника человека ), Hela (ATCC® CCL-2TM, клеточная линия рака шейки матки человека) и HepG2(ATCC® HB-8065™, клеточная линия рака печени человека) были приобретены Американской ассоциации клеточных культур (AmericanTypeCultureCollection (ATTC)), США.

Фосфатно-буферный раствор (ФБР) был получен от AMRESCO INC, Кливленд, штат Огайо, США. Используемая среда - среда Модифицированная по способу Дульбекко (Dulbecco’sModifiedEagleMedium) (DMEM с низким уровнем глюкозы и высоким уровнем глюкозы), пенициллин-стрептомицин и трипсин были получены от Gibco®, InvitrogenTM, США. Реагент для мечения МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5 дифенилтетразолиум бромид) был получен от MolecularProbes®, InvitrogenTM, Орегон, США.

Подготовка образцов

Цветки КТ были отделены от стебля и высушены на солнце при комнатной температуре (20oC ± 5oC) в течение 4 дней. До использования порошки из растения хранились в герметичном контейнере из полиэстера при температуре -20°C.

Приближенный анализ

Приближенный анализ был проведен путем использования метода, установленного Международной ассоциацией агрохимиков (AOAC International) (1990). Шесть анализов включают в себя содержание влаги, поташа, жира, белка, волокна, а также углевода. Определение содержания минералов и тяжелых металлов при помощи Индуктивно-связанного плазменного спектрофотометра оптического излучения (ИСП-ССИ)

Содержание минералов и тяжелых металлов, определенное для цветков КТ, следующее: кальций (Ca), цинк (Zn), железо (Fe), натрий (Na), марганец (Mn), медь (Cu), никель (Ni), хром (Cr), свинец (Pb), бор (B), кальций (Ca), кобальт (Co), калий (K), магний (Mg), селен (Se), мышьяк (As), а также кадмий (Cd). Данный анализ был проведен при помощи Индуктивно-связанного плазменного спектрофотометра оптического излучения (ИСП-ССИ) (OPTIMA 7000DV, PerkinElmer, США).

Расщепление и подготовка образцов

Образцы в порошковой форме были развешаны по 1 грамму (n = 3) в пробирки микроволновогодигестора и подверглись расщеплению в смеси 65-процентной азотной кислоты (HNO3) и хлорной кислоты (HCLO4) в соотношении (10:1). Образцы подвергались расщеплению в минеральном дигесторе на протяжении 60 минут. После расщепления было добавлено несколько капель концентрированной соляной кислоты (HCl). Раствор был слегка нагрет и отфильтрован. Далее фильтрат был перенесен в мерную колбу объемом 100 мл с добавлением дистиллированной воды.

 Разбавленный раствор фильтрата был перенесен в лекарственный флакон и помещен в ИСП-ССИ. Извлечение образца для проверки антипролиферативных свойств. Для водных экстрактов была использована горячая вода, для органических экстрактов - метанол. Экстракция была произведена путем растворения цветков КТ в кипящей дистиллированной воде в соотношении 1:20 (w/v) в течение 4 часов. Получившийся сырой экстракт был отфильтрован и лиофилизирован (Хуанг (Huang) и др., 2003).

Метанольный экстракт был получен путем мацерации порошков из цветка в 95-процентном метаноле на протяжении 24 часов. Фракция метанола была собрана, а остатки раствора очищены пониженным давлением при температуре 40oC с использованием роторного испарителя. Полученные остатки были высушены в осушителе до достижения постоянного веса (Викаксоно (Wicaksono) и др., 2009). Полученный экстракт был использован для демонстрации антипролиферативных свойств и хранился при температуре -20oC до следующего использования.

Экстракт был растворен в ФБР и простерилизован для анализа. Конечное разбавление осуществлялось в среде DMEM с 20-процентным ФБР. Клеточная культура MCF-7, MDA-MB-231, Caov3, Hela и HepG2 были выращены в среде DMEM с пониженным уровнем глюкозы, а Hs27 была выращена в среде DMEM с повышенным уровнем глюкозы на 4,5 г/л, что было сделано для сравнения. Клетки выращивались в питательной среде (с добавлением ФБР и 1% пенициллина-стрептомицина) и выдерживались ночь при 37oC и 5% CO2 с использованием сосудов для тканевых культур объемом 25 см2 (МакАтир (McAteer) и Дуглас (Douglas), 1979). Клеточная субкультура Клетки выращивались до конфлюэнтности 70-80% по методу Фрешни (Freshney) (1994). Для начала была удалена старая среда, затем клетки были дважды промыты ФБР.

Субконфлюэнтныймонослой был трипсинизирован и выдержан при 37oC и 5% CO2 в течение 5 минут. В сосуд было добавлено приблизительно 1-2 мл среды, и клетки были собраны в питательной среде, содержащей сыворотку. Затем клетки были повторно суспендированы в питательную среду и подсчитаны. Общее количество клеток было подсчитано посредством гемоцитометра для подготовки клеточной суспензии. Шестьдесят микролитров суспензии, содержащей 3 x 103 клеток/мл, было добавлено в каждую из 96 лунок микротитрационного планшета. Планшет выдерживался ночь при 37oC ис 5% CO2. Планшет выдерживался ночь еще раз при 37oC и 5% CO.

Измерение ингибирующего эффекта

Каждая из раковых клеточных линий выращивалась в 96-луночном микротитрационном планшете (Nunc, Дания) в объеме 60 мкл культурной среды на лунку. Здоровые и раковые клетки затем были обработаны 60 мкл экстракта из цветков КТ с последовательным разведением при дозах 0,78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 мкг/мл и температуре, поддерживаемой на уровне 37oC при CO2 в течение 24–72 часов. В клетки первого ряда 96-луночного микротитрационного планшета добавлялась свежая питательная среда для целей контроля.

После периода выдержки 24 мкл реагента для мечения МТТ-формазана было добавлено в каждую лунку. После этого микротитрационный планшет вновь выдерживался в течение 4 часов при 37oC и 5% CO2. В конце инкубационного периода среда и МТТ были удалены из всех лунок. Затем оставшиеся кристаллы МТТ-формазана были растворены 100 мкл окисленного изопропанола. Сто микролитров дистиллированной воды было добавлено в каждую лунку для дальнейшего проявления цвета.

Поглощаемость различных клеток была безотлагательно, по причине нестабильности продукта, измерена с использованием спектрофотометрического планшет-ридера (Multiskanspectrum, ThermoElectronCo., Уолтем, Массачусетс, США) с расстояния 570 нм. Для вычисления значения IC50 были выполнены нижеописанные процессы.)

Чтобы получить значение IC50, была построена кривая дозовой зависимости с использованием пробитанализа (Финней (Finney), 1962) в компьютерной программе ФиннейBioStatTM 2009 (AnalystSoftInc., Ванкувер, Канада).

Анализ Газовой хроматограммы-Масс спектрометрии

Анализы ГХ-МС были проведены для изучения летучих соединений с использованием системы ГХ, подключенной к масс-селективному детектору. Колонка была VB-1 (30 м x 320 мкм). Программирование температуры для рабочих условий было следующим: начальная температура печи - 50oC для 0 мин, увеличена до 260oC при скорости увеличения 10 oC/ мин, такая температура держалась в течение 9 мин; Температура ввода - 260oC; деление потока - 100:1; газноситель - гелий, задержка на выход растворителя - 1,70 мин; температура перехода - 260oC; температура источника ионов - 260oC и диапазон массы от 28 до 400 Да.

Статистический анализ

Результаты процентного соотношения жизнеспособности клеток были зафиксированы в качестве средних значений ± стандартная ошибка троекратных измерений. Значительные различия при множественных сравнениях были замечены при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), за которым последовал критерий Дункана с α = 0,05 с использованием статистического пакета SPSS (версии 19.0).

Результаты и описание

Результаты приближенного анализа, анализа содержания минералов и тяжелых металлов в цветках КТ представлены в Таблице 1. В приближенном анализе определенные параметры были следующими: содержание влаги, поташа, сырого жира, сырого белка, а также сырого волокна. Цветки КТ содержали значительное количество сырых волокон (2,1 ± 0,2) и жира (2,5 ± 0,1). Режим питания, включающий в себя меньше жиров и больше волокна, свидетельствовал о пониженном риске заболевания раком груди (Куши (Kushi) и др., 2012; Рабета (Rabeta) и др., 2009).

Результаты также показывают, что цветки КТ богаты кальцием (3,09 мг/г) и магнием (2,23 мг/г). Концентрации калия, цинка, натрия и железа в цветках данного растения были заметно выше (1,25, 0,59, 0,14 и 0,14 мг/г) соответственно (p < 0,05), чем большинство других проанализированных параметров (< 0,01 мг/г). К тому же, такие минералы, как кальций и магний, требуются для роста, развития скелета и других жизненно-важных процессов в теле. Железо полезно для предотвращения анемии и других связанных с нею заболеваний (Олуйеми(Oluyemi) и др., 2006), тогда как цинк принимает участие в синтезе белка, нормальном развитии тела и восстановлении после болезни (Мухаммад (Muhammad) и др., 2011).

Таблица 1. Приближенный анализ,содержание минералов и тяжелых металлов в цветках КТ

 

 

Проксимальный анализ

 

Минералы

 

Минералы

Тяжелые металлы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Влага

92.4

±0.1

Бор

0.0150±0.002

Магний

2.2306±0.134

Кадмий

< 0.0001

 

Поташ

0.45

±0.15

Кальций

3.0953±0.09

Марганец

0.0249±0.003

Мышьяк

< 0.0001

 

Жир

2.5±0.1

Кобальт

< 0.0001

Молибден

0.0001±10-4×5.7

Свинец

0.002333±0.0002

Белок

0.32

±0.03

Хром

0.0007±0.0

Натрий

0.1413±0.003

Никель

0.001267±0.0001

Сырое волокно2.1±0.2

Медь

0.0103±0.0004

Селен

< 0.0001

 

 

 

Углевод

2.23 ±0.3

Железо

0.1441±0.007

Цинк

0.5980±0.006

 

 

 

 

 

 

 

Калий

1.2506±0.235

 

 

 

 

 

   __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (СО) троекратных результатов; для приближенного анализа на сухой вес результаты выражены в процентном отношении (%), а результаты для минералов и тяжелых металлов в (мг/г).

Нехватка данных питательных веществ и минералов может пагубно сказаться на здоровье человека. Выявленные тяжелые металлы показали очень низкую концентрацию, таким образом, делая растения относительно безопасными для употребления. Рисунок 1 в процентном соотношении показывает ингибирование, оказанное водным экстрактом на здоровые клеточные линии (Hs27) и различные раковые клеточные линии человека, такие как MCF-7, MDAMB-231, Caov-3, Hela и HepG2. Ингибирование раковых клеточных линий стабильно увеличивалось с увеличением концентраций водного экстракта и с течением времени.

 КТ на MCF-7, MDA-MB-231, Caov3, Hela, HepG2 и Hs27 соответственно. A) Обработанные через 24 часа. B)       Обработанные через 48 часов. C) Обработанные через72 часа. Значения выражены как средние ± стандартнаяошибка (СО) троекратных измерений. (a, b, c) Идентичные буквы в каждой концентрацииcстатистически не сильно отличаются от других при p< 0,05






Таблица 2.IC водного и метанольногоэкстрактов  цветков КТ на раковые

 

 

 

 

 

 

 

 

Клеточные линии

24 hr

 

48 hr

72 hr

Вода

Метанол

Вода

Метанол

Вода

Метанол

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Caov3

8386.5

41333.1

857.1

2109.9

224.5

947.2

 

Hela

42274.3

20381.7

18835.4

6281.1

51513.7

2095.7

HepG2

143852

40674.6

481.5

23880

236.3

5214.1

MDA-MB-231

55355.3

-

481.5

4343.6

304.7

536.01

MCF-7

42567.6

-

1159.2

1983.4

175.35

561.3




Ингибирующее действие метанольного экстракта цветков КТ на MCF-7, MDA-MB-231, Caov3, Hela, HepG2 и Hs27 соответственно. A) Обработанные через 24 часа. B) Обработанные через 48 часов. C) Обработанные через 72 часа. Значения выражены как средние ± стандартная ошибка (СО) троекратных измерений. (a, b, c) Идентичные буквы в каждой концентрации статистически не сильно отличаются от других при p < 0,05             

 Ингибирование роста  раковой клеточной линии достигло своего пика (p < 0,05) за 72 часа. Водный экстракт не оказывал влияния на рост здоровых (нераковых) клеток.  После обработки водным экстрактом ингибирование показало больше антипролиферативных действий на MCF7, Caov3, HepG2 и MDA-MB-231 при показателе IC50 - 175,3 мкг/ мл, 224,5 мкг/мл, 236,3 мкг/мл и 304,7 мкг/мл за 72 часа соответственно, но на рост Hela

водный экстракт не повлиял (Таблица 2). Рисунок 2 показывает действие ингибитора роста метанольного экстракта на клеточные линии MCF-7 (IC50 = 536,01 мкг/мл) и MDA-MB-231 (IC50 = 561,3 мкг/мл) на 72-часовой отметке (p < 0,05). Напротив, метанольный экстракт не оказал влияния на рост Caov-3, Hela и HepG2 (Таблица 2).

Водный экстракт КТ показал более сильный антипролиферативный эффект в сравнении с метанольным экстрактом (p < 0.05). Это, возможно, объясняется присутствием более активных соединений в водном экстракте. Несколько исследований показали, что цитотоксичность и противораковые свойства натурального растения главным образом обусловлены присутствием флавоноидов.

Фенольные соединения, содержащие флавоноиды, являются наиболее перспективными факторами предотвращения рака. Это могло бы поспособствовать восприимчивости клеток к водному экстракту цветков КТ. Более того, Райан (Rajan) и др., (2011) опубликовал идентичный результат, показавший, что экстракты петролейного эфира из КТ обладали цитотоксичным действием на клеточную линию HepG2.

ШиямКумар (ShyamKumar) и Бхат (Bhat) (2011) также добавили, что петролейный эфир, извлеченный из цветков КТ, обладал цитотоксичным действием на на клеточную линию Лимфомного асцита Дальтона (DLA) На основании рост-ингибиторных свойств исследуемых экстрактов был проведен анализ ГХ-МС. Компоненты, представленные в водном экстракте цветков КТ, были следующие: инозитол (38,7%) и пентаналь (14,3%). Хроматограмма ГХ-МС метанольного экстракта (Таблица 4) показала 15 пиков, обозначающих присутствие трех фитохимических составляющих. Компоненты, представленные в метанольном экстракте цветков КТ были следующие: инозитол (33,6%), циклогексен, 1-метил-4-(1метилэтилидем) - (7,1%), уксусная кислота, циано - (6,5%) и хирустен (5,7%).

Более того, эксперименты в пробирке, испытания на животных и ограниченные клинические исследования подтверждают, что инозитол может быть эффективно использован против некоторых типов рака, в частности, в сочетании с фитиновой кислотой (Вученик (Vucenik) и Шамсуддин (Shamsuddin), 2003).  Данные соединения могут отвечать за противораковое действие, наблюдаемое в данном исследовании.  Однако, необходимы дальнейшие исследования на живых организмах, чтобы подтвердить реальные антипролиферативные свойства цветков КТ. Заключение Определенно, лучшие ингибиторы раковых клеточных линий наблюдались в водном экстракте (IC50 - 175,3 мкг/мл для MCF7).

Зная соединения экстракта, отвечающие за противораковые свойства растения, можно попытаться создать формулу противоракового средства. К тому же, это проистекает из приближенного анализа, анализ же содержания минералов в растении предоставил полезную информацию по пищевым формулам.

 

17:45:36 - 28.07.2021
Возврат к списку